吸收光谱（紫外光和可见光）

光谱法

差示分光光度法是测二种吸收光谱之差。其优点是能检出光吸收大的系统中比较小的光吸收变化。①当被测定物质浓度很大，而又不能稀释后再测定，如此测定的误差就会很大。有些高级的分光光度计虽然光吸收可以测到很高值，但也不能无限制的扩大。这种情况下可采用略低于样品浓度的已知浓度纯物质作为参考样品置于空白对照光径中，再进行未知样品浓度的测定，使得欲测定样品的读数仍然落在刻度盘读数范围内。②在研究蛋白质构象中，蛋白质或酶在加入作用物后，光谱会产生微小的变化，而蛋白质本身浓度往往较大，不容易察觉到这种微小变化。此时可在参考光径中把酶和作用物分别置于二个吸收杯中，而在测量光径中把酶和作用物放在同一个吸收杯中，而测量光径中的第二个吸收杯中仅为相应的缓冲液，这样进行波长扫描，可以清楚地观察到某些波长处的变化，并可定量。

光谱滴定

滴定法中会有 3个组分──滴定剂、被滴定物和生成物。只要这三个组分中任何一个组分有光吸收，且在滴定过程中光吸收会增强或减弱，则可利用光谱法测得其滴定终点，计算其浓度。例如滴定蛋白质中某个氨基酸残基数，可用相应的试剂，每次加入一定体积后搅拌均匀并测其光吸收。尽管每次加入试剂体积极微，但仍需进行体积校正得到校正后的光吸收值。以光吸收为纵坐标，滴定剂量为横坐标，可以得到一个光谱滴定曲线，其转折点即为滴定终点。以蛋白质量与作用试剂的化学计量之比即可计算出此氨基酸残基数。

在进行光谱分析时，除了仪器本身的性能，以及使用不妥会影响到测定结果外，还有一些因素也会影响实验结果。例如同一样品在不同溶剂中，它的吸收峰和消光系数往往不同；在不同PH下，光谱特性和光吸收也会有所变化。某些特殊情况下（例如酶反应），温度也会影响到测定，都需加以注意。